LABORATÓRIUM DIABETU A PORÚCH METABOLIZMU

1. Vedecké zameranie

Cukrovka je ochorenie, ktoré čoraz viac a viac zamestnáva myseľ vedcov, lekárov, ale aj laickej verejnosti. Príčinou tohto javu je stúpajúci počet ľudí s cukrovkou, ako aj riziko vzniku ťažkých, niekedy až život ohrozujúcich komplikácií, ktoré môžu viest k poškodeniu zraku, obličiek, nervov, srdcových a mozgovocievnych príhod a výrazne tak znížiť kvalitu života človeka, alebo viesť k predčasnému úmrtiu. Najlepším spôsobom ako predísť týmto komplikáciám u človeka s cukrovkou je efektívna liečba, ktorá závisí od typu ochorenia. Kým u detí je najčastejším typom cukrovka 1. typu s deštrukciou B-buniek autoimunitným procesom a nevyhnutnosťou liečby inzulínom, u dospelých je to cukrovka 2. typu, kde vzniká rezistencia tkanív na pôsobenie inzulínu. V oboch prípadoch ide o polygénové ochorenia, kde na ich vznik je potrebná súhra genetickej predispozície s faktormi prostredia (životný štýl, niektoré infekcie). Pribúdajúcimi pokrokmi molekulárnej biológie sa ale identifikuje stále viac a viac prípadov cukrovky, ktoré sú spôsobené poškodením – mutáciou jedného konkrétneho génu a nazýva sa monogénová cukrovka. V takýchto prípadoch má genetika rozhodujúcu úlohu a na prejavenie sa poruchy nie sú potrebné ďalšie faktory (prostredie). Podľa poškodeného génu a typu mutácie vieme v mnohých prípadoch zvoliť príčinnú liečbu, ktorá je zväčša najoptimálnejšou, najúčinnejšou a má najmenej nežiaducich účinkov. Na identifikáciu mutovaného génu sú potrebné metódy DNA analýzy. Sekcia genetiky LDPM sa zaoberá najmä výskumom v oblasti monogénovej cukrovky. Medzi monogénovú cukrovku zaradujeme cukrovku typu MODY, novorodeneckú cukrovku a cukrovku s mimopankreatickými príznakmi.

Cukrovku MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young) charakterizuje začiatok do 25. roku života, rodinný výskyt s autozómovo dominantným typom dedičnosti a neprítomnosť typických čŕt cukrovky 1. a 2. typu. Doposiaľ bolo identifikovaných viacero génov, ktorých mutácie spôsobujú MODY, medzi nimi sú aj gény pre glukokinázu, (MODY-2) a hepatálny nukleárny faktor 4A (MODY-1). Novorodenecká cukrovka. Väčšina cukrovky vzniknutej v prvom polroku života má monogénový charakter a nazýva sa neonatálny diabetes mellitus (NDM). Neonatálny diabetes, ktorý vymizne do niekoľkých týždňov, až mesiacov od vzniku sa nazýva tranzientný neonatálny diabetes (TNDM). Diabetes bez remisie má charakter permanentného neonatálneho diabetu (PNDM). Najčastejšou príčinou novorodeneckej cukrovky sú poruchy imprintingu v lokuse 6q24 (majú charakter výlučne TNDM) a mutácie génov pre Kir6.2 (Kalium inward rectifier 6.2) a SUR1 (Sulfonylurea Receptor 1) podjednotky draslíkového kanála B-buniek (podľa typu mutácie sa prejavia ako TNDM alebo PNDM). Diabetes s mimopankreatickými príznakmi. Diabetes asociovaný s inými príznakmi ako vyplývajú zo samotnej hyperglykémie či nedostatku inzulínu má často monogénový základ. Patria sem aj syndrómy výraznej inzulínovej rezistencie, ktorých príčinou je najčastejšie poškodenie inzulínového receptora. Kongenitálny hyperinzulinizmus býva spôsobený mutáciou v génoch pre Kir6.2, SUR1, GCK, HNF4A, ktoré ovplyvňujú vylučovanie inzulínu. Hyperinzulinizmus sa prejavuje včasne po narodení závažnými hypoglykémiami, ktoré môžu poškodiť činnosť mozgu s rozvojom celoživotných následkov (mentálna retardácia či poruchy motoriky). Účinná liečba priamo závisí od identifikovania presnej genetickej príčiny. Monogénové formy obezity predstavujú asi 5 % pacientov s ťažkou obezitou. K rozvoju obezity u týchto pacientov dochádza už v prvom roku života, často dosahuje závažného stupňa so skorým rozvojom závažných komplikácií. Skúmajú sa najčastejšie mutácie génov pre leptín, leptínový receptor a MC4 receptor. Monogénové dyslipidémie vznikajú mutáciou v jednom z génov, ktoré zasahujú do metabolizmu lipidov. Na rozdiel od polygénových foriem sú poruchy lipidov u monogénových dyslipidémií omnoho závažnejšie a komplikácie ako je infarkt myokardu alebo náhla cievna mozgová príhoda sa objavujú už v priebehu detstva alebo včasnej dospelosti. Vykonáva sa DNA analýza génov pre LDL-receptor, ApoB100 a PCSK9, ktoré sú najčastejšími príčinami monogénových dyslipidémií.

2. Vybrané výsledky a ich ohlas

• Identifikácia novej mutácie -71G>C pankreatického promótora glukokinázy.

V laboratóriu sa podarilo identifikovať prvú mutáciu v oblasti promótora glukokinázového génu, ktorá spôsobuje MODY-2. Našla sa vo viacerých rodinách zo Slovenska a v jednej rodine z Veľkej Británie. V in vitro analýzach sa zistilo, že znížená schopnosť väzby SP1 transkripčného faktora na mutovaný promótor vedie k jeho zníženej aktivite, a tak k zníženej expresii glukokinázy, ktorá slúži ako senzor glykémie v B-bunkách. Publikovaná práca: Gašperíková et al. Diabetes. 2009 Aug;58(8):1929-35. IF 2010 =8.889

• Mutácia P2 promótora génu pre hepatálny nukleárny faktor 4A (HNF4A).

U jednej rodiny s trojgeneračným výskytom diabetu sa identifikovala nová mutácia P2 promótora génu pre hepatálny nukleárny faktor 4 alfa (spôsobujúcu MODY-1) a v medzinárodnej spolupráci sa potvrdila jej patogenicita in vitro. Ide o jednu z prvých mutácií v P2 oblasti HNF4A génu. Wirsing et al (...Staník J, Gašperíková D a Klimeš I...). Diabet Med. 2010 Jun;27(6):631-5. IF 2010 =3.036

• Európske diagnostické odporúcania pre cukrovky typu MODY.

Rutinné sekvenovanie pankreatického promótora glukokinázy a P2 promórota HNF4A sa zavzalo aj na základe našich výsledkov do Európskych diagnostických odporúčaní pre cukrovku typu MODY, vypracovaných medzinárodným tímom vrátane prof. Klimeša a Mgr. Gašperíkovej z laboratória DIABGENE. Ellard et al. (...Gašperíková D a Klimeš I...) Diabetologia. 2008 Apr;51(4):546-53. IF 2010 =6.973

• Kauzálna liecba sulfonylureou u pacientov s Kir6.2 mutáciou.

Jedným s najvýznamnejších výsledkov práce Laboratória bol príspevok k multicentrickej medzinárodnej štúdii, publikovanej v New England Journal of Medicine v roku 2006. Objavom tejto práce bolo zistenie, že pacienti s permanentným neonatálnym diabetom na podklade mutácie génu pre Kir6.2. podjednotku K_ATP kanála v B-bunkách, môžu byt vo väčšine prípadov zmenení z liečby inzulínom na kauzálnu liečbu tabletami sulfonylurey, čo výrazne zlepšuje kompenzáciu diabetu ako aj ich kvalitu života. Pearson et al (... Klimeš I...). N Engl J Med 355(5): 467-477, 2006. IF 2010 = 53.486

• Incidencia permanentného neonatálneho diabetu v SR a zmena liečby.

Práca zahŕňa úplné epidemiologické informácie o incidencii permanentnej novorodeneckej cukrovky na Slovensku vrátane klinických detailov, ktoré sa spájajú so zmenou liečby na princípe farmakogenomickej diagnostiky. Naše slovenské údaje o incidencii permanentného neonatálneho diabetu sú v celosvetovom meradle vôbec prvými údajmi, ktoré sa počítali na báze Národného registra detského diabetu. Výsledky ukazujú, že permanentný neonatálny diabetes je oveľa častejší (1:215 417 živo narodených detí) ako doteraz tvrdili medzinárodné odhady. Stanik J, Gašperíková D,.. Klimeš I et al. J Clin Endocrinol Metab 92:1276-1282, 2007. IF 2010 = 6.495

• Funkčná charakteristika mutácie L164P génu pre Kir6.2.

Pri mutácii L164P, nájdenej u jednej slovenskej pacientky, sa funkčnou analýzou zistilo, že neurologická symptomatológia, ktorá je súčasťou klinického obrazu niektorých Kir6.2 mutácií, nemusí súvisieť s vážnosťou poškodenia funkcie kanála a citlivosťou na deriváty sulfonylmočoviny. L164P neurologickú symptomatológiu nemá, napriek tomu na sulfonylmočovinu nereaguje. Tammaro et al.(...Klimeš I...), Diabetologia 51(5):802-10, 2008. IF 2010 = 6.973

• Funkčná charakteristika mutácie R365H génu pre Kir6.2.

Funkčná analýza mutácie R365H, ktorá sa našla u pacientky s tranzientným neonatálnym diabetom však patogenitu tejto mutácie nepotvrdila. Pokračovalo sa preto v ďalšej analýze a ako príčina diabetu sa našla už popísaná abnormalita 6. chromozómu (mikroduplikácie úseku 6q24 spôsobujúce poruchu imprintingu). Táto kazuistika dokazuje nutnosť) exibility pri diagnostike NDM. Stanik J, Gašperíková D,...Klimeš I et al. Diabetes Care 31(9):1736-7, 2008. IF 2010 = 7.141

• Inzulínová rezistencia a porucha rastu pri vyváženej translokácii.

V medzinárodnej spolupráci sme zistili, že diabetes, závažná inzulínová rezistencia s poruchou rastu u matky a syna s vyváženou translokáciou [t(7,19)(p15.2;p13.2)] sú v dôsledku poškodenia génov pre inzulínový receptor a CHN2. Ide o raritný popis poškodenia dvoch génov zároveň. Suliman, Staník J, …Gašperíková D,… Klimeš I… et al. Diabetes 58(12):2954-61, 2009. IF 2010 = 8.889

• Kongenitálny hyperinzulinizmus u pacientov s mutáciou génu pre SUR1 a ich úspešná chirurgická liečba odstránením fokusu.

U dvoch pacientov so závažnými hypoglykémiami od narodenia napriek medikamentóznej liečbe a infúzii glukózy sa identifikovali inaktivačné mutácie génu pre SUR1 podjednotku K_ATP kanála B-buniek. Na základe typu dedičnosti (mutácie zdedené od otca) sa potvrdila fokálna forma hyperinzulinizmu. Po zobrazení ložiska PET-CT vyšetrením sa realizovala parciálna pankreatektómia s úplným vyliečením hypoglykémií.

3. Medzinárodná a domáca spolupráca

Prof Sian Ellard PhD FRCPath, Professor of Human Molecular Genetics and Consultant Molecular Geneticist, College of Humanities, Institute of Biomedical and Clinical Science, Peninsula Medical School, University of Exeter, Department of Molecular Genetics, Royal Devon and Exeter NHS Foundation Trust, Exeter, UK, Téma: DNA analýza monogénového diabetu

Prof Andrew Hattersley, Professor of Molecular Medicine, Peninsula Medical School, Exeter, UK, Téma: Molekulárna genetika diabetu

Prof. Anna Gloyn, Oxford Centre for Diabetes Endocrinology & Metabolism, University of Oxford, UK, Téma: Genetika glukokinázového diabetu (MODY-2)

Prof. Gerd Schmitz, Institute for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine University Hospital Regensburg, Germany, Téma: Vysokopriechodná analýza lipidov u obéznych pacientov.

Národný endokrinologický a diabetologický ústav v Lubochni

Téma: DNA analýza monogénovej cukrovky na Slovensku

I. detská klinika DFNsP a Detské diabetologické centrum SR

Téma: DNA analýza monogénovej cukrovky na Slovensku

4. Súčasné projekty

ŠF-EU Transfer poznatkov genetického endokrinologického výskumu do klinickej praxe (TRANSENDOGEN) NFP26240220051, Obdobie realizácie: 11/2010 – 08/2012, zodpovedný riešiteľ: prof. MUDr. Iwar Klimeš, DrSc.

ŠF-EU Zavedenie molekulárnej medicíny do diagnostiky, liečby a prevencie závažných civilizačných ochorení NFP26240220068, Obdobie realizácie: 02/2011 – 01/2014, zodpovedný riešiteľ za ÚEE SAV: prof. MUDr. Iwar Klimeš, DrSc.

ŠF-EU Vybudovanie Kompetenčného centra pre výskum a vývoj v oblasti molekulárnej medicíny Obdobie realizácie: 08/2011- 11/2014, hlavný riešiteľ: prof. RNDr. Ján Turňa, DrSc., zodpovedný riešitel za ÚEE SAV: prof. MUDr. Iwar Klimeš, DrSc.

ŠF-EU Centrum excelentnosti pre translančný výskum v molekulárnej medicíne (Transmed-2) NFP26240120030; Obdobie realizácie: 06/2010- 05/2012, hlavný riešiteľ: MVDr. Juraj Kopáček, DrSc., zodpovedný riešiteľ za ÚEE SAV: prof. MUDr. Iwar Klimeš, DrSc.

EHP/NFM Rozvoj molekulárno - medicínskeho centra SAV ako unikátneho pracoviska na Slovensku v oblasti modernej medicíny Obdobie realizácie: 07/2009 – 04/2011, zodpovedný riešiteľ za ÚEE SAV: Mgr. Daniela Gašperíková, CSc.

APVV-0148-10 Skríning dedičných porúch sluchu na Slovensku metódami DNA analýzy Obdobie realizácie: 05/2011- 04/2014, zodpovedný riešiteľ za ÚEE SAV: prof. MUDr. Iwar Klimeš, DrSc.

VEGA 2/0151/11 Určenie frekvencie výskytu jednotlivých podtypov cukrovky typu MODY na Slovensku; Obdobie realizácie: 2011/2013, zodpovedný riešiteľ: Mgr. Daniela Gašperíková, CSc.

VEGA 1/0465/11 Výskyt, DNA analýza a fenotypové spektrum najčastejších hereditárnych porúch sluchu na Slovensku Obdobie realizácie: 2011/2013, zodpovedný riešiteľ za ÚEE SAV: prof. MUDr. Iwar Klimeš, DrSc.

5. Založenie a poslanie laboratória DIABGENE

Laboratórium DIABGENE bolo z iniciatívy profesora Klimeša založené v roku 2003 ako spoločný projekt Laboratória diabetu a porúch metabolizmu ÚEE SAV s Národným endokrinologickým ústavom v Ľubochni. DNA diagnostické pracovisko sa nachádza v budove Ústavu experimentálnej endokrinológie v Bratislave, a vedie ho Prof. MUDr. Iwar Klimeš, DrSc.

Poslaním DIABGENE je molekulárne genetická diagnostika rôznych foriem monogénových porúch metabolizmu a sluchu u pacientov na území celého Slovenska, a klinická aplikácia výstupov výskumu. Diagnostika monogénových ochorení sa skladá z klinickej a laboratórnej časti. Klinická časť sa opiera o diagnostické kritériá, ktoré sú špecifické pre každý typ ochorenia. V rámci laboratória DIABGENE sa v spolupráci s Expertnou skupinou Slovenskej diabetologickej spoločnosti pod vedením prof. Klimeša vypracovali odporúčania etablujúce diagnostické kritériá monogénovej cukrovky aj na Slovensku (Klimeš et al., Diabetes a obezita, 8, 2008, c.15, s. 9-14). Laboratórna časť zahŕňa zisťovanie mutácií cieľových génov metódami DNA analýzy. V súčasnosti je v našej DNA banke evidovaných viac ako 1 000 pacientov s podozrením na monogénové ochocenie. Prehľad monogénových ochorení s dostupnou DNA analýzou v laboratóriu DIABGENE je uvedený v tabuľke

6. Prístrojové vybavenie a používané metodiky

DNA diagnostické laboratórium /ako člen European Molecular Genetics Quality Network, EMQN/ má k dispozícii súčasným medzinárodným štandardom zodpovedajúce vybavenie na skríning génových mutácií /dHPLC aparatúru Transgenomic, USA/, priame sekvenovanie /ABI 310 a ABI-Hitachi 3130, ABI 3500/ a identifikáciu definovaných mutácií jadrovej a mitochondriálnej DNA real-time PCR 7900HT, vybavené príslušnými softvérmi, automatickú pipetovaciu stanicu plus 3 gradientové PCR prístroje, horizontálne elektroforézy, prístroj na priame meranie koncentrácie DNA a RNA v malých objemoch vzorky, a celý rad ďalších drobných zariadení, ktoré sú potrebné na prípravu a analýzu vzoriek DNA. Toto laboratórium prevádzkuje tiež DNA banku zabezpečenú príslušným signalizačným zariadením proti znehodnoteniu vzoriek.

7. Výber najvýznamnejších publikácií (IF ≥4) pracovníkov Laboratória diabetu a porúch metabolizmu - Sekcia Genetiky.

1. Pearson E.R., Flechtner I., Njolstad P., Malecki M.T., Flanagan S.E., Larkin B., Ashcroft F.M., Klimeš I., Codner E., Iotova V., Slingerland A.S., Shield J., Robert J.J., Holst J.J., Clark P. M., Ellard S., Sovik O., Polak M., Hattersley A.T.: The Neonatal Diabetes International Collaborative Group (including Gašperíková D., Staník J.): Switching from insulin to oral sulfonylureas in patients with diabetes due to Kir6.2 mutations. N Engl J Med 355 (5): 467-77, 2006. IF(2010)=53.484

2 .Edghill El, Flanagan Se, Patch Am, Boustred C, Parrish A, Shields B, Shepherd Mh, Hussain K, Kapoor R, Malecki M, Macdonald Mj, Støy J, Steiner Df, Philipson Lh, Bell Gi: the neonatal diabetes international collaborative group (including Barák L, Gašperíková D, Klimeš I, Staník J) HEttersley at and Ellard A: Insulin mutation screening in 1044 patients with diabetes: mutations in the ins gene are a common cause of neonatal diabetes but a rarer cause of diabetes diagnosed in childhood or adulthood. Diabetes 57(4): 1034-1042, 2008. IF(2010)=8.889

3. Suliman S.G.I , Stanik J, Mcculloch L.J, Wilson N, Edghill E.L, Misovicova N, Gasperikova D, Sandrikova V, Elliott K.S, Barak L, Ellard S, Volpi E.V, Klimes I, Gloyn A: Severe Insulin Resistance and Intrauterine Growth Deficiency Associated With Haploinsuficiency for INSR and CHN2 New Insights Into Synergistic Pathways Involved in Growth and Metabolism Source. DIABETES 58 (12): 2954-2961, 2009. IF(2010)=8.889

4. Gašperíková D, Tribble N.D, Staník J, Hučková M, Mišovicová N, Van De Bunt M, Valentínová L, Barrow B.A, Barák L, Dobránsky R, Bereczková E, Michálek J, Wicks K, Colclough K, Knight J.C, Ellard S, Klimeš I, Gloyn A.L: Identification of a novel 9-cell glucokinase (GCK) promoter mutation (-71G>C) that modulates GCK gene expression through loss of allele-specific Sp1 binding causing mild fasting hyperglycemia in humans. DIABETES 58 (8): 1929-1935, 2009. IF(2010)=8.889

5.Thanabalasingham G., Gloyn A., Gasperikova D., Erling Tjora., Pederseen O., Stanik J., Klimes I., Njolstad P., McCarthy M., Owen K., Shah N., Vaxilliare, M., Hansen T., Tuomi T., Szopa M., James T., Kokko P., Loiseuer F., Andersson E., Gaget I., Isomaa B., Nowak N., Reader H., Malecki M., Groop L., Froguel P.: A large multi-centre European study validates high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) as a clinical biomarker for the diagnosis of diabetes subtypes. DIABETOLOGIA. 2011 (in press) IF(2010)=7.141

6. Klimeš I., Weston K., Kovacs P., Gašperíková D., Ježová D., Kvetnanský R., Thompson J.R., Šeböková E., Samani N.J.: Mapping of genetic loci predisposing to hypertriglyceridaemia in the hereditary hypertriglceridaemic rat: analysis of genetic association with related traits of the insulin resistance syndrome. Diabetologia 46: 352-358, 2003. IF(2010)=6.973

7. Tammaro P, Flanagan Se, Zadek B, Srinivasan S, Woodhead H, Hameed S, Klimeš I, Hattersley At, Ellard S, Ashcroft FM: A Kir6.2 Mutation Causing Severe Functional E'ects In Vitro Produces Neonatal Diabetes Without The Expected Neurological Complications. DIABETOLOGIA 51: 802-810, 2008. IF(2010)=6.973

8. Ellard S, Bellanné-Chantelot C, Hattersley AT; European Molecular Genetics Quality Network (EMQN) MODY group. (Including Klimeš, I and Gašperíková D): Best practice guidelines for the molecular genetic diagnosis of maturity-onset diabetes of the young. DIABETOLOGIA 51 (4): 546-553, 2008. IF(2010)=6.973

9. Staník J., Gašperíková D., Pašková M., BarákL., Javorková J., Jancová E., Ciljaková M., Hlava P., Michálek J., Flanagan S.E., Pearson E., Hattersley A.T., Ellard S., Klimeš I.: Prevalence of permanent neonatal diabetes in Slovakia and successful replacement of insulin with sulfonylurea therapy in KCNJ11 and ABCC8 mutation carriers. J Clin Endocrinol Metab. 92 (4):1276-1282, 2007. IF(2010)=6.495

10. Veeramah Kr, Tönjes A, Kovacs P, Gross A, Wegmann D, Geary P, Gasperikova D, Klimes I, Scholz M, Novembre J, Stumvoll M: Genetic Variation In The Sorbs Of Eastern Germany In The Context Of Broader European Genetic Diversity. Eur J Hum Genet. 2011 May 11. [Epub Ahead Of Print] IF(2010)=4.380

Zľava: Mgr. Zuzana Strapatá, Mgr. Martina Balogová, PhD., Mgr. Ivica Mašindová, PhD., MUDr. Boris Valentín, Mgr. Lucia Valentínová, PhD., Mgr. Daniela Gašperíková, CSc., prof. MUDr. Iwar Klimeš, DrSc., MUDr. Daniela Staníková, MUDr. Juraj Staník, PhD., RNDr. Miroslava Hučková, Mgr. Dominika Balážiová