LABORATÓRIUM PRE VÝSKUM STRESU (LVS)

1. Vedecké zameranie laboratória za posledných 10 rokov

Stres sa považuje za jeden z najzávažnejších zdravotných rizikových faktorov pre človeka súčasnej civilizovanej spoločnosti. Stres hrá významnú úlohu pri vzniku kardiovaskulárnych ochorení (hypertenzia, infarkt, stresom-indukované kardiomyopatie), psychických ochorení (depresia, stavy úzkosti, degeneratívne ochorenia), gastrointestinálnych porúch (žalúdočné vredy) a tiež vo vývoji imunitných a onkologických ochorení. Približne dve tretiny chorôb, ktoré sa diagnostikujú v ambulanciách lekárov, sú buď priamo vyvolané stresom alebo majú úzku súvislosť so stresovými situáciami. V strese dochádza predovšetkým k aktivácii troch regulačných systémov v organizme, ktoré sa navzájom ovplyvňujú: nervového, endokrinného a imunitného. A práve na štúdium mechanizmov aktivácie uvedených systémov a ich interakcií za stresu sa zameriava uvedené laboratórium.

V laboratóriu sa študujú predovšetkým mechanizmy aktivácie sympatikoadrenálneho systému v strese a počas adaptácie na chronické alebo intermitentné stresové podnety. Sleduje sa biosyntéza katecholamínov, ich vyplavovanie, vychytávanie a degradácia, ako aj ich adrenergické alfa a beta receptory na úrovni molekulárno-genetickej regulácie. Skúmajú sa transkripčné mechanizmy expresie génov katecholaminergného systému v periférnych orgánoch a v mnohých mikroštruktúrach mozgu po vystavení organizmu stresu. Sleduje sa interakcia tohto systému s endokrinným a imunitným systémom za stresu.

Aktivita katecholamínového systému sa sledovala aj u kozmonautov a u zvierat počas krátkodobých, ale aj dlhodobých kozmických letov. Dr. Kvetňanský koordinoval vedecké projekty počas kozmického letu prvého slovenského kozmonauta na stanici Mir.

V ostatnej dekáde sa výskum stresu zameral predovšetkým na sledovanie transkripcie génov metódami Real Time PCR s Taqmanovými próbami, ribonuclease protection assay, microarray, atď., použitím myší s „knockout“ génmi, ktoré sa chovajú na našom ústave.

Sledovala sa tiež aktivácia imunitného systému za stresu a prítomnosť genetického aparátu biosyntézy katecholamínov v iných ako nervových bunkách (kardiomyocyty, adipocyty). V uplynulom desaťročí sa v gescii laboratória usporiadali na Slovensku tri významné, medzinárodné sympózia o katecholamínoch a iných neurotransmiteroch za stresu (1993, 1997, 2011).

Orientáciou laboratória pre blízku budúcnosť je štúdium interakcie neuroendokrinných a imunitných procesov s indikátormi Alzheimerovej choroby (tauproteíny) v mikroštruktúrach mozgu zvierat exponovaných akútnemu a chronickému stresu. Tieto procesy sa budú sledovať aj u trasgénnych potkanov, ktoré javia symptómy Alzheimerovej choroby. Cieľom týchto štúdií je dôkaz predpokladaného vplyvu chronického stresu na vznik a vývoj Alzheimerovej choroby, prípadne aj jej liečba.

Stres sa považuje za jeden z najzávažnejších zdravotných rizikových faktorov pre človeka súčasnej civilizovanej spoločnosti.

2. Doterajšie konkrétne výsledky, medzinárodná spolupráca, ohlasy

V ostatnom desaťročí sa v laboratóriu dosiahli nasledovné významné výsledky:

• Upravila sa Selyeho definícia o nešpecificite stresu v zmysle, že ide o “vysoko špecifickú” odpoveď organizmu na rôzne stresory, ktorá sa potvrdila aj na úrovni expresie génov. Ako vidieť na Obr. 1. hormóny rôznych regulačných systémov sa v stresových situáciách neuvoľňujú uniformne, ako predpokladal Selye, ale sú špecificky závislé na kvalite stresového podnetu. Výsledky sa dosiahli v spolupráci s Prof. K. Pacakom z National Institutes of Health, Bethesda, USA.

Obrázok č.1.

• Dokázali sa nové molekulárno-genetické regulačné mechanizmy aktivácie sympatikoadrenálneho a neuroendokrinného systému u cicavcov počas akútneho a chronického stresu. Na Obr. 2. je uvedená prehľadná schéma vnútrobunkovej signalizácie a transkripčných faktorov, ktoré regulujú expresiu génov enzýmov katecholamínov v dreni nadobličky počas imobilizačného stresu (Kvetňanský a spol. Physiol. Reviews, 2009).

Výsledky sa dosiahli v spolupráci s Prof. E. L. Sabban z New York Medical College, USA.

• Významným pôvodným výsledkom je dôkaz biosyntézy adrenalínu a noradrenalínu v tukových bunkách ako aj prítomnosť kompletného genetického aparátu potrebného pre syntézu katecholamínov v tukových bunkách, ktoré nie sú nervovým tkanivom. V adipocytoch izolovaných z mezenterického tukového tkaniva dochádza počas vystavenia opakovanému stresu k zvýšenej tvorbe katecholamínov, čo je dôsledkom dokázanej zvýšenej expresie enzýmov TH a PNMT (Obr.3.) Zvyšuje sa predovšetkým tvorba adrenalínu v tukovom tkanive, ktorý by mohol zohrávať dôležitú úlohu v regulácii lipolýzy pri chronickom vystavení stresorom, kedy je množstvo cirkulujúcich katecholamínov produkových sympatoadrenálnym systémom nižšie v dôsledku adaptácie na stresor. Za stresu sa teda endogénna syntéza katecholamínov v adipocytoch výrazne zvyšuje, čo dokumentuje fyziologický význam tvorby katecholamínov priamo v tukových bunkách (Vargovič, Kvetňanský a spol; FEBS Letters, 2011).

Obr.3. V adipocytoch izolovaných z mezenterického tukového tkaniva sa imunohistochemicky dokázali proteíny TH aj PNMT (obrázky vľavo). Počas vystavenia opakovanej imobilizácii (7x) dochádza v adipocytoch k výraznezvýšenej tvorbe katecholamínov, v dôsledku zvýšenej expresie génov enzýmov TH a PNMT.

• V rámci vedeckého programu Štefánik, počas kozmického letu slovenského kozmonauta Bellu, ktorý koordinoval dr. Kvetňanský, sa po prvýkrát vôbec sledovala odpoveď neuroendokrinného systému na fyzický a psychický stres priamo počas kozmického letu. Výsledky ukázali zvýšenú odpoveď katecholamínov v krvi na fyzickú záťaž v podmienkach mikrogravitácie počas kozmického letu (Kvetňanský a spol. J. Gravit. Physiol., 2001).

• Novým zameraním je štúdium vplyvu stresu na imunitný systém, ktorý sme sledovali v slezine, ako aj v T- a B-lymfocytoch izolovaných zo sleziny potkanov vystavených imobilizačnému stresu (Obr. 4). Izolované T- a B-lymfocyty obsahujú endogénne katecholamíny, pričom akútna imobilizácia zvyšovala tvorbu katecholamínov v T-lymfocytoch, ale naopak znižovala v B-lymfocytoch. Expresia génu PNMT korelovala s týmito zmenami – stúpala v T- a klesala v B lymfocytoch. Vystavenie stresu viedlo v slezine k redukcii expresie génu pre β2- a α2C-adrenergické receptory, pričom expresia zápalového IL-6 sa zvyšovala (Laukova et al. Cel. Mol. Neurobiol. 2010). Jednorázová immobilizácia zároveň spôsobila v T-lymfocytoch mimoriadne neobvyklý proces translokácie β2-adrenoceptorov z bunkového jadra do cytoplazmatickej membrány (Obr. 4, vpravo). A práve jadrové β2-adrenoceptory by mohli byť cieľovým miestom pôsobenia katecholamínov syntetizovaných v lymfocytoch.

Súhrnne, výsledky predstavujú prvú evidenciu o expresii β-adrenoceptorov v T a B lymfocytoch a ich zmenách za stresu. Tieto zmeny sa podieľajú na mechanizme apoptózy v T-bunkách za stresu.

• Významné výsledky sa získali na CRH-KO myšiach neschopných tvoriť kortikoliberín a teda s vyradenou HPA osou. Ich plazmatický kortikosterón je podstatne znížený a nereaguje na vystavenie stresorom (Obr. 5). Výrazne znížená je aj hladina adrenalínu, čo je spôsobené obmedzenou reguláciou transkripcie génu PNMT (Obr. 5), ktorý má v promótore oblasť viažucu glukokortikoidný receptor. Pomocou CRH KO myší sme získali dôležité výsledky poukazujúce na esenciálnu úlohu HPA osi pri regulácii transkripcie niektorých adrenoceptorov (α2C, β3) a interleukínu 6 (IL-6) v slezine, ako aj pri regulácii fosforylácie tauproteínu pri Alzheimerovej chorobe.

3. Súčasné projekty a výskumné aktivity

Vedecké granty:

• Projekt APVV – 0088-10 (2011-2014)

„Je stres jedným z podstatných faktorov neurodegeneračného procesu pri Alzheimerovej chorobe?“

• VEGA grant - 2-0036-11 (2011-2014)

„Regulácia imunitného systému cicavcov prostredníctvom sympatikoadrenálneho a adrenokortikálneho systému počas akútneho a chronického stresu“

• VEGA grant - 2-0188-09 (2009-2012)

„Molekulárno-genetické mechanizmy regulácie sympatikového systému v tukovom tkanive cicavcov počas stresu“

Najdôležitejšie medzinárodné bilaterálne spolupráce:

• Dr. R. Kvetňanský, DrSc. - Prof. E.L. Sabban, PhD. (Department of Biohemistry and Molecular Biology, New York Medical College, Valhalla, New York, USA)

Téma: "Transkripčné mechanizmy regulácie génov katecholaminergného systému za stresu"

• Dr. R. Kvetňanský, DrSc. - Prof. K. Pacak, DrSc. (National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, USA)

Téma: "Katecholamíny, stres a nádorové ochorenia katecholaminergného systému"

V uplynulom desaťročí sa v gescii laboratória usporiadali na Slovensku tri významné, medzinárodné sympózia o katecholamínoch a iných neurotransmiteroch za stresu (1993, 1997, 2011).

4. Unikátne postupy a metódy – CRH-knockoutované myši

V rámci nášho laboratória chováme a používame tri línie „knockautovaných“ myší s vyradenými génmi pre dopamín-beta-hydroxylázu (DBH), kortikoliberín (CRH) a c-FOS. Najvýznamnejšie výsledky sme získali na CRH KO myšiach neschopných tvoriť kortikoliberín a teda s vyradenou HPA osou (Kvetňanský a spol., 2006). Ich plazmatický kortikosterón je podstatne znížený a nereaguje na vystavenie stresorom. Výrazne znížená je aj hladina adrenalínu, čo je spôsobené obmedzenou reguláciou transkripcie génu PNMT, ktorý má v promótore oblasť viažucu glukokortikoidný receptor. Pomocou CRH KO myší sme získali dôležité výsledky poukazujúce na esenciálnu úlohu HPA osi pri regulácii transkripcie niektorých adrenoceptorov (α2C, β3) a interleukínu 6 (IL-6) v slezine, ako aj pri regulácii fosforylácie tauproteínu pri Alzheimerovej chorobe.

5. Výber najvýznamnejších publikácií (IF ≥2) pracovníkov Laboratória pre výskum stresu.

Dr. Kvetňanský je celkovo autorom a spoluautorom 540 publikácií in extenso a 11 knižných publikácií. Tieto práce boli citované inými autormi viac ako 5500 krát, pri Hirschovom indexe 34.

1. Kvetňanský, R., Sabban, E.L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: Structural and molecular genetic approaches. Physiological Reviews, 89 (2), 535-606, 2009. (IF =37,047)

2. Kuo, L.E., Kitlinska, J.B., Tilan, J.U., Li, L., Baker, S.B., Johnson, M.D., Lee, E.W., Burnett, M.S., Fricke, S.T., Kvetňanský, R., Herzog, H., Zukowska, Z. Neuropeptide Y acts directly in the periphery on fat tissue and mediates stress-induced obesity and metabolic syndrome. Nature Medicine, 13 (7), 803-811, 2007. (IF = 27,887)

3. Sabban, E.L., Kvetňanský, R.: Stress-triggered activation of gene expression in catecholaminergic systems: dynamics of transcriptional events. TRENDS in Neuroscience 24: 91-98, 2001. (IF = 12,794)

4. Elenkov, I.J., Kvetňanský, R., Hashiramoto, A., Bakalov, V.K., Link, A.A., Zachman, K., Crane, M., Ježova, D., Rovensky, J., Dimitrov, M.A., Gold, P.W., Bonini, S., Fleisher, T., Chrousos, G.P., Wilder, R.L. Low- versus high-baseline epinephrine output shapes opposite innate cytokine profiles: Presence of Lewis- and Fischer-like neurohormonal immune phenotypes in humans? Journal of Immunology, 181 (3), 1737-1745, 2008. (IF = 5,646)

5. Jelokova, J., Rusnak, M., Kubovcakova, L., Buckendahl, P., Krizanova, O., Sabban, E.L., Kvetnansky, R. Stress increases gene expression of phenylethanolamine N-methyltransferase in spleen of rats via pituitary-adrenocortical mechanism. Psychoneuroendocrinology, 27 (5), 619-633, 2002. (IF = 5,528)

6. Križanová, O., Mičutková, L., Jeloková, J., Filipenko, M., Sabban, E., Kvetňanský, R. Existence of cardiac PNMT mRNA in adult rats: Elevation by stress in a glucocorticoid-dependent manner. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 281, H1372-H1379, 2001. (IF = 3,856)

7. Vargovič, P., Ukropec, J., Lauková, M., Cleary, S., Manz, B., Pacak, K., Kvetňanský, R. Adipocytes as a new source of catecholamine production. FEBS Letters 585 (14), 2279-2284, 2011. (IF = 3,601)

8. Kvetňanský, R.: Stress, Neurotransmitters, and Hormones: Neuroendocrine and Genetic Mechanisms. Annals New York Academy of Sciences, 1148, pp. 1-570, 2008. (IF = 2,648)

9. Kvetňanský, R., Kubovčáková, L., Tillinger, A., Mičutková, L., Križanová, O., Sabban E.L. Gene expression of phenylethanolamine N-methyltransferase in corticotropin-releasing hormone knockout mice during stress exposure. Cellular Molecular Neurobiology26, 733-752, 2006. (IF = 2,603)

10. Laukova, M., Vargovič, P., Križanova, O., Kvetňanský, R. Repeated stress down-regulates β2 and α2C-adrenergic receptors and up-regulates gene expression of IL-6 in the rat spleen. Cell Mol Neurobiol. 30(7), 1077-1087, 2010. (IF = 2,40)