LABORATÓRIUM MOLEKULÁRNEJ ENDOKRINOLÓGIE (LME)

1. Vedecké zameranie

Vedecká práca laboratória je zameraná na výskum charakteru a funkcie nukleárnych receptorov hormónov – ligandom indukovateľných transkripčných faktorov v organizme vo vzťahu k chemoprevencii a terapii niektorých onkologických ochorení (karcinómy štítnej žľazy, prsníka, obličiek). Plná funkčnosť jadrových receptorov v organizme je nielen nevyhnutná k biologickému účinku významného počtu hormónov, ale aj k účinku niektorých ďalších biologicky aktívnych látok. Dôsledkom rôznych zmien na úrovni nukleárnych receptorov môže dôjsť k supresii alebo dokonca až úplnej eliminácii odpovede organizmu na príslušný hormón, čo následne vedie k vzniku závažných spoločenských (?nie civilizačné?) ochorení typu čiastočnej alebo úplnej rezistencie organizmu na príslušný hormón.

Štúdium mechanizmu účinku hormónov štítnej žľazy, retinových kyselín, ako aj dihydroxyvitamínu D₃ je orientované na riešenie vplyvu vonkajších, ale aj vnútorných faktorov na expresiu, afinitu a koncentráciu transkripčných faktorov indukovateľných príslušnými hormónmi alebo biologicky aktívnymi látkami v organizme, ďalej na poznanie schopnosti týchto transkripčných faktorov viazať sa na špecifické úseky DNA, tzv. "cis-acting responsive elements“. Ďalším zámerom laboratória je prispieť k poznaniu úlohy nukleárnych receptorov v normálnom, preneoplastickom a nádorovom tkanive, ďalej priniesť nové poznatky o možnej modulácii expresie nukleárnych receptorov v rôznych experimentálnych in vitro, ako aj in vivo modeloch. Ďaľším cieľom laboratória je priniesť nové poznatky v oblasti vývoja a biologickej charakterizácie aktívnych ligandov nukleárnych receptorov vyznačujúcich sa protinádorovým účinkom. Nové ligandy nukleárnych retinoidných a retinoid X receptorov a receptora pre dihydroxyvitamín D₃, ktoré majú účasť pri indukcii príslušných transkripčných faktorov, môžu predstavovať významnú zmenu pohľadu na molekulárne procesy uskutočňujúce sa v nádorovej bunke. Získanie nových poznatkov v týchto špecifických oblastiach molekulárnej endokrinológie umožní objasniť nepoznanú vybavenosť rôznych typov ľudských nádorových buniek ligandom indukovateľnými transkripčnými faktormi.V budúcnosti očakávame získanie originálnych poznatkov najmä z oblasti výskumu biologických vlastností nových ligandov nukleárnych receptorov s minimálnymi nepriaznivými vedľajšími účinkami pre onkologického pacienta s perspektívou ich využitia v klinickej onkológii.

Vedeckým zameraním laboratória je zároveň štúdium mechanizmov regulácie procesov prebiehajúcich v ovariálnych folikuloch (steroidogenéza, expanzia oocyt-kumulárnych komplexov, meiotické zrenie oocytov), ktoré sú základom úspešnej ovulácie a fertilizácie, ako aj účinok enviromentálnych faktorov (endokrinné disruptory), faktorov životosprávy (fajčenie) a nanomateriálov na tieto procesy. Získané nové poznatky môžu prispieť k objasneniu príčin stúpajúcej infertility u žien a jej možnej liečby.

2. Vybrané výsledky, ich ohlas, dopady a medzinárodná spolupráca

Zistili sa originálne výsledky o expresii podtypov jadrových (nukleárnych) retinoidných a rexinoidných receptorov vo veľmi raritnom, avšak výrazne zhubnom nádore tzv. „Triton“- nádoru metastazujúceho do periférnych nervov (menej ako 90 zaznamenaných prípadov výskytu Tritonovho nádoru v celosvetovom meradle prevažne u pediatrických pacientov).

“Non-Hodgkinov” lymfóm štítnej žľazy tiež predstavuje vzácne sa vykytujúci nádor prevažne u starších žien. Naše laboratórium prinieslo originálne výsledky o expresii jednotlivých podtypov nukleárnych retinoidných a rexinoidných receptorov v uvedenom nádore.

Naše pôvodné poznatky a metodický potenciál z oblasti výskumu nukleárnych receptorov výrazne prispel i k spoluprácii s Oddelením chémie a biochémie na Univerzite v Salzburgu, Karlovou univerzitou v Prahe so sídlom v Plzni, Lekárskou fakultou ako aj Prírodovedeckou fakultou Palackého univerzity v Olomouci. Záujem o oblasť výskumu Laboratória molekulárnej endokrinológie, Ústavu experimentálnej endokrinológie SAV sa prejavil v minulej dekáde rokov výzvou renomovaných vedeckých inštitúcií z Francúzska, Veľkej Británie, Španielska, Nemecka a Rakúska o spoluprácu v rámci 5. Rámcového programu Európskej komisie, čo vyústilo do riešenia spoločného medzinárodného projektu (VITAGE) QLRT-1999-00830: “Vitamin A, Vitamin E and Carotenoid Status and Metabolism during Ageing: Functional and Nutritional Consequences”.Ďalej LME participovalo v riešení “Centre of Excellence” projektu taktiež v rámci 5. Rámcového programu Európskej komisie (STRESSNUTS, 200), ICA1-CT-70008 s názvom “Reduction of Negative Impact of Environmental Factors on Human Health“. Spolupráca LME s renovovanými vedecko-výskumnými inštitúciami v Európe pokračovala aj v rámci riešenia medzinárodného projektu “Network of Excellence” 6. Rámcového programu Európskej komisie (CASCADE) FOOD-CT-2004-506319 s názvom: “Chemicals as Contaminants in the Food Chain“, kde spolu s LME Ústavu experimentálnej endokrinológie ako partneri projektu participovali renomované vedecké ustanovizne vo Švédsku, Finsku, Francúzsku, Nemecku, Taliansku, Španielsku a v Maďarsku.

V rámci riešenia medzinárodného projektu “Dysregulation of Endogenous Steroid Metabolism Potentially Alters Neuronal and Reproductive System Development: Effects of Environmental Plasticizers” (ENDOMET, QLK4-CT-2002-02637) 5. Rámcového programu Európskej komisie sme ukázali, že látky používané ako plastifikátory môžu ovplyvňovať procesy nevyhnutné pre úspešnú ovuláciu a fertilizáciu. Vrámci spolupráce s Ústavom živočíšnej fyziologie a genetiky AV ČR, „Sekce reprodukce a vývojové biologie savců“, študujeme parakrinné/autokrinné pôsobenie lokálne produkovaných faktorov na intrafolikulárne procesy (zapojenie proteolytickej aktivity, úloha oocytárnych faktorov, prozápalových faktorov). V súčastnosti sa zameriavame na štúdium možného toxického účinku nanomateriálov na funkcie reprodukčného systému na úrovni ovária a hypofýzy ako nadriadenej jednotky.

3. Súčasné projekty a aktivity

LME úspešne riešilo APVV projekt s názvom: „Molekulárne mechanizmy účinku retinových kyselín vo vzťahu k terapii karcinómov štítnej žľazy, prsníka a obličky“, APVV-0120-07 (NUREX), kde zodpovedným riešiteľom bol Ing. Július Brtko, DrSc. V súčasnosti LME rieši medzinárodný APVV projekt „Aplikácia proteomických techník pre sledovanie účinkov biologicky aktívnych ligandov retinoidných receptorov využiteľných v terapii karcinómu prsníka“ APVV-SK-CZ-0211-11 (zodpovedný riešiteľ: Ing. Július Brtko, DrSc.) a ako spoluriešiteľ participuje na riešení APVV projektu „Zmeny v metabolizme bunky vyvolané nadexpresiou transportéra liečiv P-glykoproteínu v leukemických bunkách“, APVV-0290-10 (LEUPGLY). Ďalej, LME rieši projekt VEGA s názvom: „Dôsledky transaktivačných procesov sprostredkovaných transkripčnými faktormi indukovateľnými rexinoidmi v karcinóme mliečnej žľazy potkana“ 2/0022/08, kde je zodpovedným riešiteľom je Mgr. Dana Macejová, Ph.D. Zároveň sa v LME rieši VEGA projekt s názvom: „Štúdium a hodnotenie reprodukčnej toxicity nanočastíc na in vitro modeloch“ 2/0165/11, kde je zodpovedným riešiteľom Mgr. Soňa Scsuková, CSc.

4. Metodické prístupy zavedené a v poslednej dekáde rokov používané v Laboratóriu molekulárnej endokrinológie:

• Izolácia bunkových jadier cieľového tkaniva izopyknickou ultracentrifugáciou s následnou izoláciou frakcie nehistónových jadrových proteínov obsahujúcich sústavu ligandom indukovateľných transkripčných faktorov;
• Presné stanovenie afinity, koncentrácie a maximálnej väzobnej kapacity nukleárnych receptorov pre kyselinu all-trans retinovú (RAR) a nukleárnych receptorov pre 3,5,3´-trijód-L-tyronín (TR);

• Experimentálny model indukcie intraduktálnych proliferácií a karcinómu mliečnej žľazy u samíc potkanov Sprague-Dawley; Histologické vyšetrenia tkanív z experimentov.

• Gélová retardačná rádioizotopová analýza (electrophoretic mobility shift assay) pre analýzu vlastností komplexov: RA-RAR-RARE a T₃-TR-TRE, dihydroxyvitamín D₃-VDR-VDRE v normálnom, preneoplastickom a nádorovom tkanive;
• „Super-shift assay“, rádioizotopová metóda pre identifikovanie väzby jednotlivých podtypov nukleárnych receptorov pre kyselinu all-trans retinovú a 3,5,3´-trijód-L-tyronín na príslušné špecifické úseky DNA („response elements“);

• PCR techniky s využitím reverznej transkripcie pre analýzu expresie ligandom indukovateľných transkripčných faktorov (RARα, RARβ, RARγ, RXRα, RXRβ, RXRγ, TRα1, TRβ, VDR, ERα, ERβ) a ich korepresorov (N-CoR, SMRT) a koaktivátorov (SRC-1) v bunkových líniách a v tkanivách;

• Stanovenie aktivity jódtyronín 5´-dejodázy jódtyronínu typu I rádioizotopovou metódou;
• Stanovenie aktivity transglutaminázy rádioizotopovou metódou;
• Western blot metóda na analýzu syntézy proteínov
• Primárne kultúry oocyt-kumulárnych komplexov, ovariálnych granulóznych buniek a hypofyzárnych buniek
• Rádiometrické stanovenie syntézy kyseliny hyalurónovej
• Hodnotenie meiotického zrenia oocytov

5. Výber najvýznamnejších publikácií (IF ≥2) pracovníkov Laboratória molekulárnej endokrinológie.

1. Paris M., Escriva H., Schubert M., Brunet F., Brtko J., Ciesielski F., Roecklin D., Vivat-Hannah V., Jamin E.L., Cravedi J-P., Scanlan T.S., Renaud J-P., Holland N.D., Laudet V.: Amphioxus post-embryonic development reveals the homology of chordate metamorphosis. Curr. Biol., 18: 825-830, 2008. (IF: 10,539)

2. Scsucova S, Palacios D, Savignac M, Mellström B, Naranjo JR, Aranda A: The repressor DREAM acts as a transcriptional activator on vitamin D and retinoic acid response elements. Nucleic Acids Research 33: 2269-2279, 2005. (IF: 7,836)

3. Brtko J., Rock E., Nezbedová P., Križanová O., Dvorčáková M., Minet-Quinard R., Farges M-C., Ribalta J., Winklhofer-Roob B.M., Vasson M-P., Macejová D.: Age-related change in the retinoid X receptor beta gene expression in peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteers: Effect of 13-cis retinoic acid supplementation. Mech. Ageing Dev., 128: 594-600, 2007. (IF: 5.799)

4. Brtko J., Thalhamer J.: Renaissance of the biologically active vitamin A derivatives: Established and novel directed therapies for cancer and chemoprevention (Invited review). Curr. Pharm. Design, 9: 2067-2077, 2003. (IF: 4,774)

5. Macejová D., Rádiková Ž., Macho L., Liška J., Brtko J.: MNU-induced carcinogenesis of rat mammary gland: Effect of thyroid hormone on expression of retinoic acid receptors in tumours of mammary gland. Mol. Cell. Endocrinol., 244: 47-56, 2005. (IF: 4,119)

6. Mlynarčíková A, Kolena J, Ficková M, Scsuková S: Alterations in steroid hormone production by porcine ovarian granulosa cells caused by bisphenol A and bisphenol A dimethacrylate. Mol. Cell. Endocrinol. 244: 57-62, 2005. (IF: 4,119)

7. Dvořák Z., Vrzal R., Ulrichová J., Macejová D., Ondková S., Brtko J.: Expression, protein stability and transcriptional activity of retinoic acid receptors are affected by microtubules interfering agents and all-trans retinoic acid in primary rat hepatocytes. Mol. Cell. Endocrinol., 267: 89-96, 2007. (IF: 4,119)

8. Brtko J., Dvorak Z.: Role of retinoids, rexinoids and thyroid hormone in the expression of cytochrome P450 enzymes. Current Drug Metabolism, 12: 71-88, 2011. (IF: 3,896)

9. Macejová D., Ondková S., Jakubíková L., Mlynarčíková A., Scsuková S., Liška J., Brtko J.: MNU-induced mammary gland carcinogenesis: Chemopreventive and therapeutic effects of vitamin D and Seocalcitol on selected regulatory vitamin D receptor pathways. Toxicol Lett., 207: 60-72, 2011. (IF: 3,581)

10. Macejová D., Križanová O., Brtko J.: Different mRNA expression profiling of nuclear retinoid, thyroid, estrogen and PPARgamma receptors, their coregulators and selected genes in rat liver and spleen in response to short-term in vivo administration of 13-cis retinoic acid. Toxicol. Lett., 184: 114-120, 2009. (IF: 3,249)

12. Szabová Ľ., Macejová D., Dvorčáková M., Mostböck S., Blažíčková S., Zórad Š., Walrand S., Cardinault N., Vasson M-P., Rock E., Brtko J.: Expression of nuclear retinoic acid receptor in peripheral mononuclear cells (PBMC) of healthy subjects. Life Sci., 72: 831-836, 2003. (IF: 2,454)

13. Mlynarčíková A., Nagyová E., Ficková M., Scsuková S.: Effects of selected endocrine disruptors on meiotic maturation, cumulus expansion, synthesis of hyaluronan and progesterone by porcine oocyte-cumulus complexes. Toxicol. in vitro 23: 371-377, 2009. (IF: 2,473)

Obr.1 Personálne obsadenie LME. Zľava: MUDr. V. Lenko, MVDr. J. Liška, CSc., M. Danihelová, Mgr. D. Macejová, PhD., Ing. L. Bialešová., Mgr. S. Scsuková, CSc., D. Zemeková, Ing. J. Brtko, DrSc.