LABORATÓRIUM BUNKOVEJ ENDOKRINOLÓGIE (LBE)

1. Vedecké zameranie laboratória.

Oblasť výskumu v posledných desiatich rokoch bola zameraná na :

a) poznanie úlohy transmembránového segmentu EGF receptora pre aktiváciu EGF receptorových intracelulárnych dráh proliferácie buniek;

b) objasnenie zmien hormonálne regulovaného metabolizmu tukového tkaniva účinkom psychotropných látok u potkanov;

c/ objasnenie vplyvu endokrinného systému na vznik a priebeh reumatoidnej artritídy u ľudí a adjuvantnej artritídy u zvierat;

d/ štúdium molekulových a bunkových procesov účinku endokrinných disruptorov s estrogénovou aktivitou na rast a proliferáciu buniek a procesy steroidogenézy v ovariálnych granulóznych bunkách.

2. Vybrané výsledky

a/ Receptor pre EGF je transmembránový (TM) glykoproteínový monomér. Väzba ligandu iniciuje dimerizáciu receptora a aktiváciu/fosforyláciu tyrozín kinázy intracelulárnej domény. Signalizacná dráha fosforylačno-defosforylačných reakcií výsledne indukuje proliferáciu, diferenciáciu, migráciu a metabolizmus normálnych buniek. Nadmerná expresia receptorov s tyrozín kinázovou aktivitou je prítomná v mnohých formách ľudskej rakoviny. Naše výsledky ukázali, že interakcie medzi TM doménami sú aktívnou súčasťou dimerizácie/aktivácie EGF receptora. Predpoklad inhibície receptorovej dimerizácie cestou ovplyvnenia TM interakcií bola potvrdená: i) in vitro po zabudovaní syntetického EGFr-TM do membrány ľudských nádorových buniek prsníka, ii) transfekciou týchto buniek plazmidovou DNA kódujúcou TM. Špecifický inhibičný účinok bol dokázaný na úrovni fosforylácie receptora a zníženia fosforylácie proteínov intracelulárnej signalizačnej dráhy (vybrané pulikácie 1).

b/ Systémové pôsobenie dlhodobého (28 dní) ad libitum príjmu 6 % alkoholu v pitnej vode indukovalo významné zmeny endokrinných a metabolických vlastností tukového tkaniva pokusných zvierat, potkanov. Zaznamenal sa pokles príjmu pevnej stravy/energetický príjem, pokles prírastku telesnej hmotnosti a veľkosti tukového tkaniva, zmenšenie adipocytov. Zvýšený počet receptorov pre inzulín a vyššia expresia proteínu alfa-podjednotky inzulínového receptora v adipocytoch sprevádzal pokles stimulačného účinku inzulínu na transport glukózy do adipocytov. Diskrepancia týchto parametrov indikuje prítomnosť porušenej inzulínovej citlivosti/účinku na úrovni tukového tkaniva. Dôkazom porušeného vnútrobunkového prenosu signálu z receptor-inzulínového komplexu je znížená expresia proteínu aj génu pre inzulínový receptorový substrát 1. Pokles hladiny mRNA pre jadrový receptor PPAR2 podmienil znížený rozsah adipogenézy a pokles inzulínom stimulovaného transportu glukózy do adipocytov. Endokrinnú aktivitu tukového tkaniva charakterizuje sekrécia adipokínov, ktoré následne ovplyvňujú/regulujú príjem/energetickú a metabolickú homeostázu. Zvýšené hladiny leptínu a rezistínu (inzulín inhibujúce účinky) v dôsledku dlhodobého príjmu alkoholu ovplyvnili nepriamo, cez centrálny nervový systém, príjem potravy/energetický výdaj a priamym pôsobením v periférnych tkanivách indukovali lokálnu inzulínovú rezistenciu. Zvýšená hladina a expresia génu pre adiponektín (inzulín senzitizujúci účinok) svojim kontraregulačným pôsobením prispeli k absencii systémovej inzulínovej rezistencie. Dlhodobý príjem alkoholu ovplyvňuje sekréciu a expresiu génov pre adipokíny a účinok inzulínu; tieto zmeny podmieňujú poruchy metabolickej a energetickej rovnováhy (vybrané publikácie 5,7).

c/ Hladiny hormónov v synovialnej tekutine kĺbov môžu lokálne ovplyvňovať synoviálne a imunitné bunky a reguláciou produkcie cytokínov modulovať priebeh reumatoidného zápalu. Porovnanie hladín hormónov v synovialnej tekutine kolena u pacientov s reumatoidnou artritídou (RA) a skupiny pacientov s nezápalovým exudátom pri osteoartróze ukázalo, že u pacientov s RA sú v synovialnej tekutine zvýšené hladiny prozápalovo pôsobiacich estrogénov. Mierne sa zvýšila aj koncentrácia testosterónu, ale pomer hladín estradiol/testosterón bol u reumatikov výrazne vyšší. Ďalej sa v synoviálnej tekutine zistili aj zvýšené hladiny progesterónu, aldosterónu a rastového hormónu, ktoré tiež prispievajú k aktivácii autoimunného zápalu. V synovialnej tekutine sa zistila aj prítomnosť inzulínu, rastového hormónu, C-peptidu a prolaktínu (vybrané publikácie 2,3).

d/ Endokrinné disruptory sú látky, ktorých primárnym účinkom je ovplyvnenie endokrinnej homeostázy cez receptorom sprostredkované účinky, syntézu alebo metabolizmus hormónov. Podskupinou sú xenoestrogény, ktoré interferujú s pôsobením prirodzených estrogénov v zmysle ovplyvnenia proliferácie buniek (karcinogenéza) a steroidogenézy. Patria sem deriváty fenolov a ftalátov používané ako plastifikátory, detergenty, pesticídy, ktoré cestou znečistenia životného prostredia a uvoľňovaním do potravinového reťazca sa dostávajú do ľudského a živočíšneho organizmu. Najrozšírenejším xenoestrogénom je bisfenol A (BPA), ktorý vo vysokých dávkach inhiboval expanziu prasacích oocyt-kumulárnych komplexov, jadrové dozrievanie oocytov, blokoval kompletizáciu meiózy, v granulóznych bunkách znižoval produkciu estradiolu stimulovanú FSH. Ďalšími originálnymi výsledkami je zistenie inhibície bazálnej a stimulovanej produkcie progesterónu fenolmi mechanizmom modulácie cAMP-signálnej dráhy a enzýmov steroidogenézy. Negatívne ovplyvnenie procesov v somatických a zárodočných bunkách xenoestrogénmi môže prispievať k reprodukčným problémom a nárastu výskytu malígnych ochorení reprodukčných orgánov (vybrané publikácie 4,6,8,9,10).

3. Metodické postupy používané v laboratóriu

In vitro štúdie na bunkových líniách:

a) MCF7 – ľudské adherentné rakovinové bunky prsníka, ktoré v nadmernom množstve

exprimujú estrogénový receptor typu alfa;

b) LNCaP adherentné androgén-citlivé ľudské prostatické adrenokarcinómové bunky,

ktoré v cytozole a v jadrových frakciách exprimujú špecifické androgénové receptory:

i) meranie proliferácie buniek a de novo syntéza DNA;

ii) meranie expresie proteínov a génov zapojených do proliferačného mechanizmu

účinku;

iii) meranie expresie proteínov a génov anti-apoptického mechanizmu účinku;

c) In vitro štúdie ma primárnych bunkových kultúrach – prasacích ovariálnych

granulóznych bunkách:

i) meranie aktivity enzýmov steroidogenézy;

ii) stanovenie produkcie sekundárnych signalizačných poslov.

4. Aktuálne vedecko-výskumné aktivity, súčasné projekty riešené v laboratóriu

VEGA 2/0107/10, 2010-2012: Účasť antiapoptózy v mechanizme proliferačných účinkov priemyselných xenoestrogénov vo vzťahu ku karcinogenéze.

Projekt je zameraný na bližšiu špecifikáciu mechanizmu proliferačných účinkov xenoestrogénov fenolového typu v zmysle anti-apoptického pôsobenia. Ďalej sa projekt venuje objasneniu účinkov týchto priemyselných látok v kombinácii s prirodzeným hormónom, estradiolom, v zmysle synergického alebo aditívneho účinku na rast buniek.

APVV-0147-10, 2011-2014. Objasnenie účinku vybraných endokrinných disruptorov zvyšujúcich riziko vývoja nádorov prsníka, prostaty a ovariálnych disfunkcií.

Cieľom projektu je in vitro štúdium mechanizmu pôsobenia vybraných endokrinných disruptorov a ich zmesi s prirodzenými hormónmi na :

- proliferáciu buniek ľudského karcinómu prsníka a buniek ľudského karcinómu prostaty – genomické a negenomické mechanizmy účinku ;

- procesy steroidogenézy v ovarialnych granulóznych bunkách, identifikácia negenomických účinkov na intrafolikulárne procesy (určenie intracelulárnych signálnych dráh).

5. Zoznam udelených zahraničných grantov

1/ EK, Brusel/CNRS Francúzsko: Modulation of adipocyte structure and function by dietary fish oil, CIPA-CT-92-0162, 1993;

2/ INSERM, Francúzsko: Effets des acides gras de type n-3 sur la sensibilité d´ adipocytes, Cooperation Est/Ouest 1994, 02/1994-12/1995;

3/ INSERM, Francúzsko: Rôle du segment transmembranaire des récepteurs á tyrosine kinase: étude sur cellules entiéres, 4E010B, 01/1996-12/1997;

4/ EK, Brusel: 5 RP EK – Dysregulation of endogenous steroid metabolism potentially alters neuronal and reproductive system development: Effects of environmental plasticisers, QLRT – 2004 -02637, 01/2003-06/2006;

5/ ŠTEFÁNIK, bilaterálny slov.-francúzsky projekt s partnerským pracoviskom INSERM U575 v Štrasburgu: Transmembrane interactions in cellular signalling. 2006-2007.

6. Medzinárodná spolupráca

Dr R.H.Waring, School of Biosciences, University of Birmingham, Birmingham, Veľká Británia

Dr. D. Bagnard a dr. G. Cremel, INSERM U575, Štrasburg, Francúzsko

Dr. O. Puig, Inst. of Biotechnology, University of Helsinki, Finland

Dr. Amar Bennasroune, Laboratoire des Interactions, Ecotoxicologie, Biodiversité, Ecosystèmes, CNRS UMR 7146 Mety

Dr. Pierre Hubert, LISM, CNRS UPR 9027, Marseille Francia

7. Výber najvýznamnejších publikácií (IF ≥2) pracovníkov Laboratória bunkovej endokrinológie.

1. Bennasroune A., Fickova M., Gardin A., Dirrig-Grosch S., Aunis D., Cremel G., Hubert P.:Transmembrane peptides as inhibitors of ErbB receptor signaling. Mol Biol Cell. 2004 Jul;15(7):3464-74. IF=7,454

2. Imrich R., Rovensky J., Zlnay M., Radikova Z., Macho L., Vigas M., Koska J.: Hypothalamic pituritary adrenal axis function in ankylosis spondylitis. Ann. Rheum. Dis., 63, 671-674, 2004, IF 3,916

3. Mlynarcikova A., Fickova M., Scsukova S.: The effects of selected phenol and phthalate derivatives on steroid hormone production by cultured porcine granulosa cells. Altern Lab Anim. 2007 Mar; 35(1):71-7, IF 3,203

4. Mlynarcikova A., Kolena J., Fickova M., Scsukova S.:Alterations in steroid hormone production by porcine ovarian granulosa cells caused by bisphenol A and bisphenol A dimethacrylate. Mol Cell Endocrinol. 2005 Oct 10; 244 (1-2):57-62, IF=2,786

5. Mlynarcíková A., Nagyová E., Ficková M., Scsuková S.: Effects of selected endocrine disruptors on meiotic maturation, cumulus expansion, synthesis of hyaluronan and progesterone by porcine oocyte-cumulus complexes. Toxicol In Vitro. 2009 Apr; 23(3):371-7. IF=2,473

6. Nagyova E., Camaioni A., Scsukova S., Mlynarcikova A., Prochazka R., Nemcova L., Salustri A.: Activation of cumulus cell SMAD2/3 and epidermal growth factor receptor pathways are involved in porcine oocyte-cumulus cell expansion and steroidogenesis. Mol Reprod Dev. 2011, 78(6): 391-402. IF = 2.395

Obr.1. Personálne obsadenie laboratória. Zľava: Mgr. A. Mlynarcíková, PhD, Mgr. T. Havránek, MUDr. L Macho, DrSc., RNDr. M.Ficková, CSc.